小鼠白脂素 (Asprosin) ELISA技術指南：精準檢測脂肪因子的關鍵工具

小鼠白脂素 (Asprosin) ELISA 試劑盒技術指南：精準檢測脂肪因子的關鍵工具

摘要： 小鼠白脂素 (Asprosin) 是一種新近發現的脂肪因子，在葡萄糖代謝、食欲調節等生理過程中扮演重要角色。酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 是定量檢測生物樣本中小鼠 Asprosin 的金標準。本文詳細介紹了小鼠 Asprosin ELISA 試劑盒的工作原理、實驗流程、關鍵優化步驟、數據分析方法及應用領域，為研究人員提供全面的技術參考。

一、 引言：Asprosin 的重要性與檢測需求
白脂素 (Asprosin) 主要由白色脂肪組織分泌，其異常表達與胰島素抵抗、肥胖、多囊卵巢綜合征 (PCOS) 等代謝性疾病密切相關。研究小鼠模型中的 Asprosin 水平對于理解其生理病理機制至關重要。小鼠 Asprosin ELISA 試劑盒提供了一種高特異性、高靈敏度、可重復性強的方法，用于定量檢測血清、血漿、細胞培養上清液及組織勻漿液等樣本中的 Asprosin 濃度。

二、 試劑盒核心工作原理 (雙抗體夾心法 ELISA)

1. 包被 (Coating): 微孔板預先包被有高親和力的抗小鼠 Asprosin 單克隆抗體 (捕獲抗體)。

2. 加樣與結合: 樣本或標準品加入孔中。樣本中的小鼠 Asprosin 抗原被捕獲抗體特異性結合，洗滌去除未結合物質。

3. 檢測抗體孵育: 加入生物素標記的抗小鼠 Asprosin 檢測抗體 (多為另一表位的單克隆抗體)，形成 “捕獲抗體-Asprosin-生物素化檢測抗體" 復合物，再次洗滌。

4. 酶聯反應: 加入辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的鏈霉親和素 (Streptavidin-HRP)。鏈霉親和素與生物素發生高親和力結合。

5. 底物顯色: 加入無色的 TMB (3,3',5,5'-四甲基聯苯胺) 底物溶液。HRP 催化 TMB 氧化，生成藍色產物。

6. 終止與測定: 加入酸性終止液 (通常為硫酸)，反應終止，藍色轉變為穩定的黃色。使用酶標儀在 450nm 波長 (參考波長通常為 570nm 或 630nm) 測定各孔的吸光度 (OD 值)。

7. 定量分析: 樣品中 Asprosin 的濃度與測得的 OD 值成正比。通過標準品濃度與其對應 OD 值繪制標準曲線，即可計算出未知樣本的 Asprosin 濃度。

三、 標準實驗流程概覽

1. 試劑準備: 將所有組分平衡至室溫 (約 30 分鐘)，按說明書配制洗滌液、標準品、生物素化抗體工作液、SABC 工作液、TMB 顯色液等。

2. 標準品稀釋: 用標準品稀釋液將凍干的標準品進行系列梯度稀釋 (通常設 7-8 個點)。

3. 加樣孵育:

• 將標準品、待測樣本加入對應微孔。

• 密封，室溫或 37°C 孵育一定時間 (如 90-120 分鐘)。

• 洗板 (通常 3-5 次)。

4. 檢測抗體孵育:

• 加入生物素化抗體工作液。

• 密封，室溫或 37°C 孵育 (如 60 分鐘)。

• 洗板。

5. 酶聯反應:

• 加入 SABC 工作液。

• 密封，室溫避光孵育 (如 30 分鐘)。

• 洗板。

6. 顯色反應:

• 加入 TMB 顯色液，室溫避光孵育 (如 15-30 分鐘)，觀察顏色變化。

7. 終止與讀值:

• 加入終止液，輕搖混勻，顏色由藍變黃。

• 立即在 450nm 處讀取 OD 值 (建議 5-30 分鐘內完成)。

四、 關鍵考量與優化步驟 (提升數據可靠性)

1. 樣本采集與處理:

• 血清/血漿: 使用 EDTA 或肝素抗凝管收集血液，避免溶血。離心分離后立即分裝，-80°C 凍存，避免反復凍融 (凍融 ≤ 3 次)。

• 組織勻漿: 精確稱重，加入適量 PBS 或裂解液，冰上充分勻漿。高速離心 (如 4°C, 10000-14000g, 5-10 分鐘) 后取上清檢測。注意: 裂解液成分可能干擾檢測，需評估或稀釋。

• 細胞上清: 離心去除細胞碎片后凍存。

2. 標準曲線:

• 嚴格按照說明書稀釋標準品，涵蓋預期樣本濃度范圍。

• 每次實驗必須包含標準曲線。

• 選擇合適的數據擬合模型 (通常為四參數或對數-邏輯回歸)。

3. 精密度控制:

• 板內精密度: 同一塊板上同一樣本復孔檢測的變異系數 (CV) 應 < 10%。

• 板間精密度: 不同實驗日、不同批次試劑盒檢測同一樣本的 CV 應 < 15%。

4. 準確度控制 (回收率實驗):

• 在已知濃度的樣本 (基質匹配) 中加入已知量的 Asprosin 標準品。

• 檢測實際測得值，計算回收率 (Recovery = (實測值 - 本底值) / 加入值 * 100%)。理想范圍通常為 80%-120%。

5. 靈敏度與特異性:

• 靈敏度 (檢測限 - LoD): 通常定義為空白孔均值 + 2SD 或 3SD 對應的濃度。優質試劑盒 LoD 可達 pg/mL 級別。

• 特異性: 確保抗體對僅識別小鼠 Asprosin，不與其他小鼠脂肪因子或相關蛋白發生交叉反應。

6. 干擾因素排除:

• 鉤狀效應 (Hook Effect): 對于超高濃度樣本 (>標準曲線最高點)，可能導致 OD 值假性降低。對預期高值樣本進行 預稀釋 后復測確認。

• 基質效應: 樣本中非目標成分可能干擾抗原抗體結合或顯色。通過加標回收率實驗和樣本稀釋線性實驗評估。若存在顯著基質效應，需優化稀釋倍數或更換樣本類型/處理方法。

• 溶血、脂血、黃疸: 可能影響吸光度讀數，應避免或評估影響。

五、 數據分析與結果報告

1. 計算標準品和樣本復孔的平均 OD 值。

2. 扣除空白孔 OD 值 (通常為 0 標準品孔或單獨的空白孔)。

3. 使用專業軟件 (如 GraphPad Prism, ELISA Analysis Excel 模板) 以標準品濃度為 X 軸 (對數坐標)，對應的平均 OD 值為 Y 軸 (線性坐標)，繪制標準曲線，并進行四參數或對數-邏輯回歸擬合。

4. 將樣本的平均 OD 值代入擬合方程，計算出樣本濃度。

六、 應用領域
小鼠 Asprosin ELISA 試劑盒廣泛應用于：

1. 基礎研究: 探究 Asprosin 在肥胖、糖尿病、脂肪肝、PCOS 等小鼠模型中的表達調控及生理病理作用機制。

2. 藥效評估: 評價潛在藥物或干預措施 (如飲食、運動) 對小鼠 Asprosin 水平的影響。

3. 生物標志物研究: 探索 Asprosin 作為代謝性疾病小鼠模型診斷或預后生物標志物的價值。

七、 常見問題解答 (FAQ)

• Q: OD 值普遍偏低/高可能是什么原因？

• A: 孵育時間/溫度不足/過高；試劑失效；洗板不充分/過度；酶污染/失活；底物失效；讀數波長錯誤；樣本中 Asprosin 含量過低/過高 (需稀釋)。

• Q: 標準曲線線性差 (R2 < 0.99) 怎么辦？

• A: 檢查標準品稀釋是否準確；確保移液器校準；檢查孵育條件是否均一；避免孔間污染；確認試劑混合均勻無沉淀；嘗試不同的曲線擬合模型。

• Q: 復孔間差異大 (CV > 10%)？

• A: 加樣操作需更精準；洗板需且均一 (確保每孔注滿洗滌液)；混勻步驟要輕柔充分；避免孔邊緣效應 (孵育時密封膜貼緊)。

• Q: 樣本值超出標準曲線范圍？

• A: 必須對樣本進行適當倍數稀釋后重新檢測，使稀釋后濃度落在標準曲線范圍內。結果乘以稀釋倍數。

九、 結論
小鼠 Asprosin ELISA 試劑盒是研究這一重要脂肪因子的強大工具。通過嚴格遵守操作規程，注重樣本處理、標準曲線制備、質控措施和干擾排除等關鍵環節，研究人員可以獲得可靠、準確的 Asprosin 定量數據，為深入理解其在代謝健康和疾病中的作用奠定堅實基礎。持續關注試劑盒性能驗證數據和技術進展，是確保研究質量的關鍵。